Сайт СФУ
Сибирский форум. Интеллектуальный диалог
декабрь / 2018 г.

Уникальное прочтение: в России создают геномный секвенатор пятого поколения

GAMMA-DNA — имя молодой компании, поставившей амбициозную цель — создание первого отечественного одномолекулярного безметочного секвенатора ДНК. В конце следующего года макет прибора должен быть представлен публике. С чего начался этот уникальный российский стартап и почему сегодня генетический паспорт не менее важен, чем паспорт гражданина, рассказывает профессор Гёттингенского университета (Германия), адъюнкт-профессор Техасского университета A&M (США), ведущий научный сотрудник Института общей генетики им. Вавилова РАН, научный директор Центра геномных
исследований Сибирского федерального университета Константин КРУТОВСКИЙ.

— Константин, вы назвали этот проект мощным, уникальным, стоящим на передовом крае мировой науки. Расскажите предысторию, с чего всё началось.

— В прошлом десятилетии в США появились первые секвенаторы второго поколения, позволяющие прочитывать нуклеотидные «тексты» ДНК параллельно — сразу по большому числу фрагментов. Выделяемая ДНК «нарезалась» на относительно короткие фрагменты случайным образом, затем эти фрагменты «прочитывались», т.е. определялась последовательность нуклеотидов, и затем из этих «прочтений» складывался исходный текст.

Если традиционно сравнить геном с книгой, то в каждой клетке нашего тела содержится инструкция, в соответствии с которой клетки, ткани и органы развиваются, взаимодействуют и функционируют. Текст-то есть в полном объёме, хотя не весь он читается (экспрессируется) в каждой из клеток. Но когда мы выделяем тотальную ДНК из биологической ткани, то мы выделяем её в полном объёме и одновременно из многих клеток; т.е. в каждом образце оказывается много миллионов копий одной и той же книги, если продолжить сравнение.

Технологии секвенирования второго поколения не позволяют читать весь текст с начала и до конца, нам доступны лишь фрагменты. «Книга» режется на короткие фразы и предложения, разбросанные в хаотическом беспорядке. После, при помощи специальных технологий прочитывания через синтез, вдоль каждого фрагмента синтезируется по циклам новая ДНК, регистрируется каждое новое присоединение буквы-нуклеотида к новому тексту, копирующему исходный фрагмент, и мы получаем несколько миллионов так называемых коротких прочтений (англ. short reads). Технология позволяет сгенерировать множество этих прочтений одновременно, а дальше нужно их сложить, как пазл, в осмысленный текст — эту задачу решают биоинформатики. Только в отличие от пазлов, каждый фрагмент которых имеет уникальный рисунок и форму, наши короткие прочтения содержат массу повторов.

Пользуясь литературными аналогиями, можно сказать, что человеческий геном — это книга, написанная постмодернистом. Некоторые предложения или даже страницы в ней повторяются, какие-то перевёрнуты, некоторые — читаются задом наперёд, а какие-то и вовсе отсутствуют. Текст перемешан, часто искажён, в нём встречаются ошибки — мутации, перестройки, делеции (потери участков хромосом) и дупликации (удвоения участков хромосом).

Сейчас на рынке доступны и пользуются спросом секвенаторы третьего и четвёртого поколения, прочитывающие длинные фрагменты (до ста тысяч «букв»-нуклеотидов). В дополнение к секвенаторам второго поколения (Illumina HiSeq2000 MiSeq) такой прибор (Oxford Nanopore MinION) приобретён в рамках мегагранта и функционирует в Центре геномных исследований СФУ. К сожалению, эти «нанопоровские» секвенаторы имеют свои недостатки: очень высокие требования к целостности выделяемой ДНК, большой процент ошибок в прочтениях и относительно низкая производительность, не позволяющая секвенировать de novo большие геномы.

Цель проекта GAMMA-DNA — создать такой секвенатор, который будет сочетать преимущества всех предыдущих разработок второго, третьего и четвёртого поколений. Это будет своего рода пятое поколение на рынке приборов для сложных полногеномных исследований. Думаем, что наша новинка сможет прочитывать сравнительно большое количество длинных фрагментов генома качественно и безошибочно, а ещё мы сможем масштабировать мощность прибора или даже делать разные его вариации для решения разноуровневых задач. Это просто «бомба»! В основе лежит совершенно уникальный метод считывания нуклеотидов. Насколько я знаю, такого красивого, простого и одновременно функционального решения не существует на данный момент ни у одного производителя современных секвенаторов.

— Где планируется применять новый секвенатор и кто его потенциальные покупатели?

— В первую очередь в профилактической и персонифицированной медицине. За разумную себестоимость (порядка 100$ США) и достаточно быстро (секвенирование займёт 4 часа, включая подготовку проб) посетители медицинских и перинатальных центров смогут заказать секвенирование и расшифровку своего генома.

Более того, считаю, что эта услуга должна покрываться страховкой — как известно многие болезни значительно легче и, следовательно, дешевле предупредить, чем лечить. Таким образом, от этого выигрывают не только пациенты, но и страховые компании или государство, оплачивающие лечение. Пациенты получат исчерпывающую картину того, какие гены достались им от предыдущих поколений по наследству, в том числе и вновь приобретённые мутации, к каким заболеваниям конкретно имеется существенная предрасположенность, какие лекарства или методы лечения более эффективны. Особенно это касается заболеваний со сложной этиологией, которые зависят от многих генов, таких как некоторые формы диабета, сердечно-сосудистых и онкологических заболеваний, психических расстройств и т.д.

Таким образом, иметь индивидуальный генетический паспорт очень выгодно как для прогнозирования серьёзных заболеваний и их превентивного лечения, так и для индивидуального подбора медикаментов и стратегий лечения. Лечение будет на основе строго индивидуализированного подхода к каждому пациенту, получившему такой паспорт.

Что касается перинатальных центров — мы надеемся, что наш секвенатор поможет ещё до рождения обнаруживать неблагополучные генотипы и мутации, которые можно будет корректировать и, таким образом, предупреждать развитие некоторых неблагополучных состояний у детей. Например, некоторые расстройства метаболического, аутического характера или шизофрения, по имеющимся медицинским данным, имеют наследственную компоненту, которую можно обнаружить, прочитав геном. Для этого понадобится небольшое количество биоматериала, клеток плода, присутствующих в околоплодной жидкости матери.

В принципе, такую пренатальную диагностику ещё нерождённого плода уже научились делать медики, но она пока ограничена анализом относительно небольшого числа генов. ДНК плода в следовых количествах присутствует и в крови матери. Биоинформатически возможно отделить нуклеотидные сиквенсы, принадлежащие плоду, от тех, что принадлежат матери, и проанализировать плод по всему известному спектру патологий, связанных с генетическими изменениями. Этот неинвазивный метод позволяет снять риск осложнений, связанных с пункциями при взятии околоплодной жидкости.

Можно использовать GAMMA-DNA в криминалистике — проводить с его помощью генетическую идентификацию людей. Очень хорошие перспективы у нашей разработки в области геномной селекции.

— Расскажите о команде проекта. Кто эти смелые (и умелые), рискнувшие своим именем и репутацией в научном мире. Готовы ли они — и вы — идти до конца?

— Начиналось всё, как и положено, с группы энтузиастов. Во главе стоял Михаил ГУТОРОВ из Зеленограда, который окончил в своё время Московский физико-технический институт по специальности «Автоматические и информационные устройства». В конце 1980-х годов он был одним из разработчиков первого в СССР цифрового фотоаппарата. В начале 1990-х был создан прототип, но до реализации дело не дошло по известным причинам… Сейчас Михаил является генеральным и техническим директором нашего проекта, главной его движущей силой.

О том, как я стал членом этой замечательной команды, можно написать целый роман. Это ведь далеко не первая попытка сделать собственный отечественный секвенатор. Ряд институтов РАН, Курчатовский институт, различные ООО в Черноголовке, Зеленограде и Красноярске бились много лет над этой задачей. В 2011 году меня пригласили красноярские физики поучаствовать в их проекте по разработке сенсорного чипа для секвенирования на основе полупроводников, однако их идея и подходы к реализации были недостаточно зрелыми, и проект не получил продолжения.

Но меня эта проблема глубоко заинтересовала. В апреле 2012 года был создан Научно-образовательный центр геномных исследований как структурное подразделение Сибирского федерального университета, который я возглавил. Это был тогда один из нескольких геномных центров в стране, у которых были современные секвенаторы нового поколения. Фактически мы были вторые в стране, у кого появился секвенатор HiSeq2000 компании Illumina, самый производительный на то время. Об этом узнал Михаил и где-то в 2012 году прислал мне письмо, рассказал про свой проект и предложил присоединиться к его команде, что я с большой радостью и сделал.

У коллег была адекватная рабочая концепция создания секвенатора, имелось представление о техническом решении и, главное, существовала целая команда специалистов-энтузиастов из различных научных и коммерческих областей, и все они были настроены на победу. Не хватало специалиста с практическим знанием современных технологий секвенирования, каковым оказался я, поскольку считаю себя не столько экспертом в разработке технологий секвенирования ДНК, сколько скорее «продвинутым юзером», как сейчас любит говорить молодёжь.

Позднее, к счастью для проекта, нам удалось также привлечь талантливого специалиста в области молекулярной биологии и генетики, моего старого приятеля ещё по аспирантуре Владимира БАШКИРОВА. Он имеет большой опыт по разработке и совершенствованию технологий секвенирования для известных платформ SOLiD (Applied Biosystems), StarLight Single-Molecule Sequencing (Life Technologies), Revolocity (Complete Genomics). Считаю, что он значительно усилил команду — Владимир отвечает за техническое воплощение нашего метода секвенирования и помогает наладить связи с зарубежными производителями некоторых компонентов.

Управляющим партнёром по развитию и привлечению инвестиций в наш проект является замечательная Надежда МАТВЕЕВА с большим опытом развития и реализации инвестиционных высокотехнологичных проектов.

Познакомившись ближе с командой, я окончательно поверил в проект — да, эти ребята «настоящие», они смогут.

— Кто ваши конкуренты в научном мире?

— Когда мы только начали обсуждать проект, многие мои коллеги, друзья и те, кто хорошо разбирается в технологиях секвенирования ДНК, сомневались в реализуемости задуманного. «Неужели вы рассчитываете успешно конкурировать с компаниями-монстрами, такими как Illumina?» (американская компания Illumina с 1998г. производит линейку продуктов и услуг для секвенирования, генотипирования и изучения экспрессии генов. Штаб-квартира находится в Сан-Диего, Калифорния — прим. автора) — это самые безобидные вопросы, которые нам задавали. На сегодняшний день Illumina владеет почти 70-80% мирового рынка секвенирования, фактически монополист. Её клиенты — это крупнейшие центры изучения геномов, авторитетные фармацевтические компании, университетские центры, организации, осуществляющие клинические исследования, биотехнологические компании. На научные исследования эта компания выделяет сотни миллионов долларов. На неё работают сотни специалистов по микрофлюидике, электронике, наноматериалам. Бюджет корпорации исчисляется миллиардами долларов США…

В начале ноября мир облетела новость: Illumina купила другую калифорнийскую компанию, занимающуюся геномными исследованиями, — Pacific Biosciences (PacBio). Теперь они владеют технологиями и коротких, и длинных прочтений, но фактически делают эти процессы на разных приборах, тогда как наш GAMMA-DNA способен производить оба процесса одновременно.

— Как вы стали резидентами Сколково? Какое впечатление лично на вас производит сотрудничество с отечественным инновационным кластером?

— Наш проект прошёл отбор и стал резидентом Сколково. На данный момент это наиболее разумное решение для реализации планов, поскольку Сколково даёт не только грантовую поддержку наиболее прорывным проектам, но и мощное содействие развитию и продвижению, обеспечивая возможность участия в наиболее интересных инициативах, общения с ключевыми партнёрами и потенциальными заказчиками. На данный момент мы получили грант Сколково на реализацию макета секвенатора, арендуем лабораторию в Технопарке Сколково, приняли участие в Открытых инновациях 2018, в конкурсе проектов Национальной технологической инициативы и заняли первое место в треке HealthNet.

— На сайте проекта gamma-dna.ru идёт интерактивный отсчёт — чуть более 200 дней осталось до…

— ...запуска макета и демонстрации первого сиквенса заказного олигонуклеотида! Это важнейший этап создания одномолекулярного безметочного секвенатора нового поколения, снятие ключевых венчурных рисков.

В нашем приборе задействованы особые платы — микрочипы с полупроводниковыми сенсорами, на которых будет происходить процесс циклического синтеза ДНК. Они изготавливаются из наноматериала со сложной «подложкой». В каждой ячейке платы должна, согласно нашей задумке, помещаться ровно одна молекула ДНК-полимеразы (фермента, участвующего в репликации ДНК, — прим. автора). Ячейки обязаны быть определённого размера в нанометрах. Такие наноразмерные транзисторы (сенсоры) можно заказать у компании TSMC (Taiwan Semiconductor Manufacturing Company).

Кроме того, нам требуется модифицированная «долгоиграющая» ДНК-полимераза, которая должна «сесть» точно в подготовленные ячейки и химически как бы «приклеиться» к ним. Теперь предстоит решить задачу: собрать полупроводниковый сенсор, на который будет осуществляться подача реактивов по циклам. Это сложный электронный прибор с тонкой «химией», но не такой замороченный, как у той же Illumina. Почему? Да потому что нам этого и не требуется.

В итоге мы будем использовать механизм полупроводникового считывания, но принцип считывания будет совершенно иной, чем используется компанией Thermo Fisher Scientific.

Будем рады поделиться новостями на сайте через 200 дней!

Татьяна МОРДВИНОВА